2024宁夏吴忠知识大全：细胞复苏能不洗吗@网站小助手
博凌科为解答：【材料】1.常规细胞培养仪器设备 恒温水浴振荡器。2.培养液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亚砜（DMSO）【操作程序】1.细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。2.培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。3.二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，备用。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6.用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。7.记录复苏日期。【注意事项】1.取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。5.细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。6.复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。
真核细胞通常悬浮在带有血清和冷冻剂的培养基内，保存在-196°C 的液氮中。如果是商业订购的，通常储存在用干冰包裹的冻存管中。所以冻存后的细胞必须快速解冻后立即培养，以获得最大的生存能力，为了除去冻存时的添加剂， 24 小时后要更换培养基。
一、材料
培养基， 37’C 预热
培养瓶
装有70 ％乙醇的烧杯
1ml 、10ml 的移液管、移液器及移液头
二、步骤
把冻存细胞的管子在37’C 的水浴融化，快速摇动， 1分钟内使管内的细胞融化。
把融化的管子浸入装有70 ％乙醇的烧杯内，整个实验在超净台内进行。
小心打开冻存管，不要让乙醇浸入管内。
将冻存管内的细胞转移到培养瓶中，并立即加入预热的培养基。
盖好培养瓶的盖子，培养24 小时。
用新培养基替换老培养基。
继续培养2~3 天或按说明书上的建议进行操作。
三、温馨提示
1.融解的细胞必须马上培养，如果来不及培养，就保存在液氮中。
2.细胞通常冻存为1 ml 的体积，加入新的培养基至10ml 。
3.可以在融化了冻存细胞后，把细胞离心下来，并用新鲜的培养基重新悬浮细胞，这种做法只适用于那些对冻存剂敏感的细胞，或者笫二天因为有事不能更换新培养基的情况。
可以从以下三方面查找原因：
1、冻存前的消化过程：杂交瘤细胞为半贴壁细胞，有可能你的消化程度没有掌握好，致使消化过度。
2、收集细胞的离心操作：细胞消化后进行离心，以收集细胞，如果离心速度太大对细胞也会损伤有加，一般要求离心速度是不大于1000rpm，时间不多于5min，温度是室温。
3、冻存过程：该过程是个逐渐降温的过程，不能降温太急剧，一般是4度放置20min，-20度放置不超过30min（最好不要超过30min），然后放入超低温冰箱或液氮中保存。你的细胞在-20度放置的时间太长了。
4、复苏过程：与冻存过程相比，复苏过程要求尽量短时间内完成操作，从超低温冰箱取出冻存管直接在37度水浴溶解，一边摇动帮助溶解。
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