2023内蒙古锡林郭勒知识大全：tam诱导mcf-7细胞实验过程@网站小
chip实验原理在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 chip实验步骤具体如下：第一天：(一)、细胞的甲醛交联与超声破碎。1、取出 1 平皿细胞( 10cm 平皿)，加入 243ul 37 %甲醛，使得甲醛的终浓度为 1%。(培养基共有 9ml )2、37 摄氏度孵育 10min。3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为 0.125M 。450ul 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置 5min 即可。4、吸尽培养基，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。5、细胞刮刀收集细胞于 15ml 离心管中(PBS 依次为 5ml ，3ml 和 3ml )。预冷后 2000rpm 5min收集细胞。6、倒去上清。按照细胞量，加入 SDS Lysis Buffer 。使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×106 个细胞。这样每 100ul 溶液含 1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7 长满板为 5×106 个细胞。本次细胞长得约为 80%。即为 4×106 个细胞。因此每管 加 入 400ul SDS Lysis Buffer 。将 2 管混在一起，共 800ul 。7、超声破碎： VCX750 ， 25%功率， 4.5S 冲击， 9S 间隙。共 14 次。当然，如果实验室有Bioruptor 这种神器的话那就轻松了。 (二)、除杂及抗体哺育。8、超声破碎结束后， 10， 000g 4 度离心 10min 。去除不溶物质。留取 300ul 做实验，其余保存于-80 度。300ul 中， 100ul 加抗体做为实验组; 100ul 不加抗体做为对照组; 100ul 加 入 4ul 5M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2M )， 65 度处理 3h 解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。9、在 100ul 的超声破碎产物中，加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20ul 的 50×PIC。再各加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 。4 度颠转混匀 1h。10、 1h 后，在 4 度静置 10min 沉淀， 700rpm 离心 1min 。11、取上清。各留取 20ul 做为 input 。一管中加入 1ul 抗体，另一管中则不加抗体。 4 度颠转过夜。(三)、检验超声破碎的效果。取 100ul 超声破碎后产物，加入 4ul 5M NaCl ， 65 度处理 2h 解交联。分出一半用酚 /氯仿抽提。电泳检测超声效果。第二天：(一)、免疫复合物的沉淀及清洗。12、孵育过夜后，每管中加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 。4 度颠转 2h。13、 4 度静置 10min 后， 700rpm 离心 1min 。除去上清。14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在 4 度颠转 10min ，4 度静置 10min 沉淀， 700rpm 离心 1min ，除去上清。洗涤溶液： a. low salt wash buffer----one washb. high salt wash buffer-----one washc. LiCl wash buffer------one washd. TE buffer------two wash15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方： 100ul 10 % SDS， 100ul 1M NaHCO3 ， 800ul ddH2O ，共 1ml 。每管加入 250ul 洗脱 buffer ，室温下颠转 15min ，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。终的洗脱液为每管 500ul 。16、解交联：每管中加入 20ul 5M NaCl (NaCl 终 浓 度为 0.2M )。混匀，65 度解交联过夜。 第三天： (一)、DNA 样品的回收17、解交联结束后，每管加入 1ul RNaseA ( MBI )， 37 度孵育 1h。18、每管加入 10ul 0.5M EDTA ， 20ul 1M Tris.HCl ( PH 6.5)， 2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45 度处理 2h。19、 DNA 片段的回收 ――― omega胶回收试剂盒。终的样品溶于 100ul ddH2O 。(二)、PCR 分析ChIP 技术总结(一)关于细胞细胞的生长状态要好。 因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络， 也很有可能影响你所研究的 TF 与其靶 Promoter 的结合。一般细胞长到 75%- 80%比较好。(二)关于抗体抗体是实验成败的致命因素之一!必须是 IP 级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和 santa cruz 的抗体，即使是 IP 级别的。单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。 两种抗体各有利弊。 单抗特异性强，背景低。 但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在 ChIP 甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭， 导致单抗不能识别靶蛋白。 多抗虽然没有这个问题， 但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域) ，选择多抗比较稳妥一些。(三)关于交联与超声破碎这一块的确是 ChIP 实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。交联不充分，只有一部分靶蛋白与其 Promoter 相结合，富集得到的 Promoter 的量不高，实验假阴性。 交联过充分， 基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。一般来讲，按照经验，交联条件取决于细胞类型。 不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如： NIH - 3T3 的交联条件是室温( 25 摄氏度)下 15min ， 1%的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor 这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是 200bp- 1000bp。但是 200bp- 2000bp 的范围也是可以接受的。(四)关于操作希望尽可能的保持低温( 4 度)。沉淀的时候可以先在 4 度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速( 500rpm 等)离心使其完全沉降。虽然说明书上说 ChIP 实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到 PCR 结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。(五)关于解交联虽然说明书上说 4 小时已经足够， 但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA 不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在 EP 管口封上封口膜。(六)关于 DNA 片段的回收需要注意的是：样品中 SDS 样品较高，普通的 PCR 产物回收试剂盒回收，很有可能会在终的样品中混入 SDS，影响 PCR 实验结果。小 Tip ：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除 SDS 沉淀。
什么是染色质免疫共沉淀技术（ChIP）？ 染色质免疫共沉淀法是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。这项技术主要用来分析目标基因有没有活性、或者分析一种已知蛋白(转录因子)的靶基因有哪些。真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。 CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。 一、CHIP常见用途 1、DNA甲基化 脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点,即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80%-90%的CpG位点已被甲基化,但是在某些特定区域,如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56%的哺乳动物基因中的启动子有关。1%-2%的人类基因组是CpG群,并且CpG甲基化与转录活性成反比。 2、蛋白质甲基化 蛋白质甲基化一般指精氨酸或赖氨酸在蛋白质序列中的甲基化。精氨酸可以被甲基化一次(称为一甲基精氨酸)或两次(精氨酸甲基转移酶(PRMTs)将两个甲基同时转移到精氨酸多肽末端的同—个氮原子上成为非对称性甲基精氨酸,或者在每个氨端各加—个甲基成为对称性二甲基精氨酸)赖氨酸经赖氨酸转移酶的催化可以甲基化一次、两次或三次。在组蛋白中,蛋白质甲基化昰被研究最多的一类。在组蛋白转移酶的催化下,S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到组蛋白。某些组蛋白残基通过甲基化可以抑制或激活基因表达,从而形成为表观遗传。蛋白质甲基化是翻译后修饰的一种形式。 3、组蛋白修饰 在保持组蛋白和DNA联合的同时,染色质被切成很小的片断,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,将目标片段(发生组蛋白特异标记的片段)沉淀下来。此外H4—K20的甲基化与基因沉默相关,H3—K36和H3—K79的甲基化与基因激活有关。但应当注意的是,甲基化个数与基因沉默和激活的程度相关。 4、DNA甲基化 活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 组蛋白修饰包括组蛋白甲基化和乙酰化，都用 ChIP assay那是如何知道我是想检测甲基化水平还是乙酰化水平？ 抗体→甲基化转移酶/乙酰化酶特异性抗体. 二、CHIP原理 利用抗体专一性特征，检测蛋白质-蛋白质相互作用。 1、染色质免疫共沉淀 研究蛋白质与核酸相互结合的技术。 甲醛固定时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。 细胞内，能够相互结合的蛋白与基因靠的比较近，或者契合在一起。此时甲醛处理能使它们之间产生共价键而绑定在一起。 2、染色质结构 染色质由紧密聚集的组蛋白和DNA，以及结合在DNA上的其他物质组成。 3、染色质免疫共沉淀 利用甲醛交联蛋白与核酸，使蛋白质抗体沉淀蛋白-核酸复合物后，检测蛋白质上的核酸。 三、CHIP 示例 1、 CHIP-qPCR 研究 VCaP细胞在有或无E2处理时 ERα 聚集到 NEAT1 启动子区。 IgG或ERα抗体沉淀下复合物后，针对猜测的DNA序列设计引物检测是否有特定的DNA序列与Erα结合。适用于想要研究某个特定蛋白是否结合自己猜测的基因。需要针对基因不同区段设计引物。 2、 CHIP-seq 研究 SW480细胞内转录因子P53结合的mRNA、蛋白质、基因。 细胞经处理后进行CHIP，利用P53抗体沉淀复合物，然后分离纯化复合物内核酸进行高通量测序。适用于想要研究某个特定蛋白，但是不知道结合的基因有哪些。 3、 CHIP-qPCR 研究细胞在转染sh-RNA或对照后，分别采用RA处理后H3K56Ac结合的lncRNA和基因细胞经处理后进行CHIP，利用H3K56Ac抗体沉淀复合物，然后分离纯化复合物内核酸，使用预测的引物检测lncRNA或基因富集。适用于研究或验证与lncRNA结合的蛋白。
低温诱导植物染色体数目变化的实验怎么做
（1）由于实验是低温诱导植物染色体数目的变化，所以在实验过程中，要将整个培养装置放入冰箱的低温室内；细胞有丝分裂装片制作过程为取材→解离→漂洗→染色→制片→观察，所以实验中将漂洗与染色颠倒了；细胞在低温下不会都发生变异，而且大多数细胞处理分裂间期，所以低温条件下根尖只有部分细胞染色体数目发生变化或者没有细胞发生染色体数目变化，而不可能所有细胞染色体数目都加倍．
（2）低温导致染色体加倍的原因是抑制纺锤体的形成和细胞分裂，导致细胞中染色体数目加倍．温度不同，诱导的效果也不一样；要探究诱导染色体数目变化的最适温度，需要设置不同温度梯度的对照组，观察并比较结果．
（3）利用显微镜观察洋葱根尖细胞有丝分裂时，在不同的视野中，看到的细胞情况不相同．表中两个样本表示两个不同视野所看到的处在分裂各期的细胞数目；由于洋葱体细胞的一个细胞周期约为12h，所以间期为85÷100×12=10.2h．
（4）减数第一次分裂后期同源染色体分离，染色体数目不变，而有丝分裂后期着丝点分裂，染色体数目加倍．所以判断的依据是细胞中染色体数目是否相同或有无染色单体．
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